Resumen
Las características de las células madre mesenquimales (MSC) derivadas del ligamento cruzado anterior (LCA), como la proporción y el potencial multilinaje, pueden verse afectadas por la edad del donante. Sin embargo, las características cualitativas y cuantitativas de las MSC del LCA aisladas de individuos más jóvenes y mayores aún no se han comparado directamente. Este estudio evaluó las diferencias fenotípicas y funcionales en ACL-MSC aisladas de donantes más jóvenes y mayores y evaluó la correlación entre la proporción de ACL-MSC y la edad del donante. Se recogieron restos desgarrados del LCA de 36 pacientes sometidos a reconstrucción del LCA (jóvenes: 29,67 ± 10,92 años) y 33 sometidos a ATR (antiguos: 67,96 ± 5,22 años) y se midió la proporción de sus MSC. La proporción media de MSC fue ligeramente mayor en las muestras de LCA más antiguas del grupo de ATR que en el grupo de reconstrucción de LCA más joven (19,69 ± 8,57 % frente a 15,33 ± 7,49 %, p = 0,024), pero las proporciones de MSC en los pasajes 1 y 2 fueron similares. Las MSC de ambos grupos poseían una potencialidad multilinaje comparable, ya que podían diferenciarse en adipocitos, osteocitos y condrocitos a un nivel similar. No se observaron correlaciones significativas entre la edad del paciente y las proporciones de MSC en los pases 0 a 2 o entre la edad y la proporción de MSC tanto en el grupo de reconstrucción del LCA como en el de ATR. El análisis de regresión lineal múltiple no encontró ningún predictor significativo de la proporción de MSC, incluida la edad del donante, para cada pase. El análisis de microarrays identificó varios genes que estaban regulados de manera diferencial en ACL-MSC de pacientes ancianos con ATR en comparación con pacientes jóvenes con reconstrucción de ACL. Los genes de interés codifican componentes de la matriz extracelular (ECM) y, por lo tanto, pueden desempeñar un papel crucial en la modulación de la homeostasis, remodelación y reparación del tejido en respuesta a daños o enfermedades. En conclusión, la proporción de ACL-MSC recién aisladas fue mayor en pacientes ancianos con ATR que en pacientes más jóvenes con desgarros del LCA, pero su potencial fenotípico y multilinaje fue comparable.
Introducción
Las células madre mesenquimales (MSC) tienen propiedades de autorrenovación, alta capacidad proliferativa y potencial inherente de diferenciación multilinaje, lo que sugiere su posible uso para la regeneración de tejidos o la reparación de tejidos dañados.1,2). Si bien la médula ósea es una buena fuente de MSC(3), estas células también se pueden aislar de otros tejidos mesenquimales adultos, incluida la grasa (4), hueso trabecular (5), membrana sinovial (6), líquido sinovial (7) y ligamento cruzado anterior (LCA)(8). Como el LCA desgarrado generalmente se descarta durante la reconstrucción del LCA y el LCA degenerativo se elimina durante la artroplastia total de rodilla (ATR), estos tejidos extirpados pueden ser una fuente potencial de MSC.
Porque la generación de MSC multipotentes derivadas de ACL capaces de diferenciarse en células diana de manera reproducible y controlada es fundamental para el éxito clínico(9), la calidad y pureza de las MSC aisladas de tejidos de ACL ex-vivo son importantes. A pesar del uso potencial de las MSC derivadas de ACL (ACL-MSC) en aplicaciones clínicas, especialmente para proporcionar fuentes de células para la reconstrucción de ligamentos y tendones, se sabe poco sobre su utilidad. ex-vivo Propiedades de las ACL-MSC. Además, dado que las edades de los pacientes que se someten a la reconstrucción del LCA y los que se someten a una ATR difieren notablemente, es importante evaluar el efecto de la edad del donante sobre la proporción y el potencial multilinaje de las MSC aisladas del tejido del LCA. Sin embargo, hasta la fecha, las características cualitativas y cuantitativas de las ACL-MSC aisladas de pacientes más jóvenes y mayores no se han comparado directamente. Por lo tanto, este estudio fue diseñado para evaluar las diferencias fenotípicas y funcionales en las ACL-MSC aisladas de donantes más jóvenes y mayores, así como la correlación entre la proporción de ACL-MSC aisladas y la edad del donante. Nuestra hipótesis es que la proporción de MSC en muestras de LCA es mayor en pacientes más jóvenes sometidos a reconstrucción del LCA que en pacientes mayores sometidos a ATR, y que la proporción de MSC se correlaciona negativamente con la edad del donante.
Para definir mejor las diferencias entre las ACL-MSC de pacientes con ATR y reconstrucción de ACL, comparamos los perfiles de expresión génica de estas MSC mediante análisis de microarrays. Los análisis de microarrays se han utilizado para evaluar los perfiles de expresión génica en MSC derivadas de diversas fuentes, como la membrana sinovial(10,11), menisco, ligamento intraarticular(12), médula ósea(13), cordón umbilical (14), y tejido adiposo(15). Estos estudios sugieren que los genes que participan en diversos procesos biológicos, inmunológicos y metabólicos podrían regularse de manera diferencial para la supervivencia, el crecimiento y el desarrollo de las células madre. Los patrones de expresión génica de las MSC podrían revelar información adicional sobre el efecto de la edad en las propiedades de las MSC y proporcionar pistas para mejorar el potencial de regeneración tisular de estas MSC para aplicaciones terapéuticas.
Materiales y métodos
Declaración de ética
La aprobación ética de este protocolo de estudio fue otorgada por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Anam de la Universidad de Corea (permiso n.° AN09041). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos antes de participar en este estudio (se obtuvo el consentimiento de los padres/tutores para los menores).
Diseño de estudio y recolección de muestras de ACL.
Este estudio prospectivo inscribió a todos los candidatos a ATR debido a osteoartritis grave y a todos los candidatos a reconstrucción del LCA debido a rupturas aisladas del LCA, según lo confirmado por imágenes por resonancia magnética (IRM) y exámenes físicos, como pruebas positivas del cajón anterior, de Lachmann y/o de cambio de pivote (más de grado II). Se excluyeron los pacientes con diagnósticos distintos a la osteoartritis (por ejemplo, artritis piógena, artritis reumatoide o desgarros traumáticos de menisco) y aquellos sometidos a ATR de revisión. Los pacientes con otras lesiones intraarticulares concomitantes (por ejemplo, lesiones de menisco o ligamentos) o lesiones extraarticulares asociadas, y aquellos sometidos a reconstrucción de revisión del LCA, también fueron excluidos para excluir cualquier efecto de otras fuentes potenciales de MSC sobre la proporción de MSC en los injertos de LCA. Las muestras del LCA se recuperaron fácilmente de pacientes sometidos a ATR, porque se resecó todo el LCA. En pacientes sometidos a reconstrucción del LCA, se recogieron restos del LCA desgarrados con fórceps hipofisarios.
Aislamiento y cultivo celular.
Para el aislamiento celular, se utilizaron las mismas áreas (sustancias medias) del ligamento en cada paciente para obtener células P0. La vaina sinovial y los tejidos grasos se eliminaron cuidadosamente para obtener sólo los fascículos del LCA. Las muestras de ACL se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1X, se trituraron en trozos pequeños y se incubaron con colagenasa tipo I al 3% (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, Nueva Jersey, EE. UU.) en PBS 1X a 37°C. Después de 2 horas, las muestras digeridas se lavaron con PBS 1X, se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 minutos y se aspiraron los sobrenadantes. Los sedimentos se reconstituyeron en 50 ml de PBS 1X y se filtraron a través de un filtro celular de nailon de 70 μm (BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.), utilizando un émbolo de jeringa de 15 ml para eliminar los residuos. Las suspensiones se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 min y se desecharon los sobrenadantes. Los glóbulos rojos se lisaron añadiendo 1 ml de tampón de lisado ACK (NH 150 mM).4Cl, KHCO 10 mM3Na 0,1 mM2EDTA, pH 7,2–7,4) durante 5 min a temperatura ambiente (RT). El tubo se cubrió con PBS 1X y las células se filtraron a través de una malla de nailon, se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos y se resuspendieron en medio completo de crecimiento de células madre mesenquimales Poietics (MSCGM) (Lonza Walkersville, Inc., Walkersville, MD, EE. UU.).
Expansión celular
1×105 Las MSC primarias derivadas de ACL se cultivaron durante 14 días en 10 ml de MSCGM y se incubaron en un CO humidificado al 5%.2 incubadora a 37°C. Luego, las células se separaron con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1 mM en PBS y se contaron usando Trypan Blue (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.). 1×105 Se sembraron células P1 en una placa de cultivo de 100 mm de diámetro que contenía 10 ml de MSCGM, se incubaron en una incubadora de CO2 al 5 % a 37 °C y se recogieron después de 7 días para obtener células P2 (16,17).
Citometría de flujo
Se realizaron ensayos de citometría de flujo para caracterizar la proporción de MSC derivadas de ACL en las células de los pases 0, 1 y 2. Las células cultivadas se recogieron con EDTA 1 mM en PBS, se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos y se resuspendieron en 1 ml de MSCGM. 1×105 Las células se transfirieron a un tubo de fondo redondo de poliestireno (BD Biosciences), se centrifugaron a 1500 rpm durante 3 minutos y se resuspendieron en 100 μl de tampón FACS que contenía anticuerpo monoclonal (mAb). Después de la incubación durante 20 minutos a 4°C, las células se lavaron con 1 ml de tampón FACS y se fijaron en 300 µl de paraformaldehído al 1% en PBS. Se adquirieron y analizaron cincuenta mil células por muestra utilizando un instrumento FACSCanto II (BD Biosciences) y FlowJo. Los anticuerpos primarios incluyeron mAb antihumano CD34 conjugado con isotiocianato de fluoresceína, mAb antihumano CD90 conjugado con peridinina clorofila proteína-cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5) y mAb antihumano CD105 (endoglina) conjugado con aloficocianina (APC), adquiridos en eBioscience (San Diego, CA, EE. UU.); y mAb CD44 antihumano conjugado con ficoeritrina de BD Biosciences. Las MSC se definieron como células triple positivas para CD44, CD90 y CD105 y negativas para CD34. Las células adquiridas se clasificaron como P1 y la expresión superficial de CD44, CD90 y CD105 se evaluó en poblaciones de CD34 (Figura 1).
Las células de las muestras de reconstrucción de ATR y ACL en (A) pase 0, (B) pase 1 y (C) pase 2 se tiñeron con anticuerpos contra CD34, CD44, CD90 y CD105 y se analizaron mediante citometría de flujo. Las poblaciones CD34 negativas se seleccionaron en poblaciones vivas (P1); Las poblaciones positivas para CD44 se registraron en poblaciones negativas para CD34; Las poblaciones positivas para CD90 y CD105 se registraron en poblaciones positivas para CD44. Los histogramas representativos se muestran en líneas azules, mientras que las líneas rojas representan controles de isotipo.
Confirmación de la multipotencialidad de MSC.
Para la adipogénesis, 1,9 x 104 Las células en el paso 1 o 2 se sembraron en una placa de 24 pocillos y se cultivaron en 1 ml de MSCGM. Luego, el medio se cambió a 1 ml de medio de diferenciación de adipogénesis STEMPRO completo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) una vez que las células tuvieron una confluencia del 100 %. Las células se mantuvieron en medio adipogénico durante 2 semanas con cambios de medio dos veces por semana. Los cultivos adipogénicos se fijaron en formalina al 10% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) durante 1 h a temperatura ambiente y se tiñeron con una solución fresca de Oil Red O (stock: 0,3% en isopropanol, se mezclaron tres partes de stock con dos partes de agua y se filtraron a través de un filtro de 0,2 m; Sigma-Aldrich) durante 1 h a temperatura ambiente. Luego se lavaron las células con agua hasta que los lavados salieron claros. Las células se visualizaron con un microscopio óptico y se fotografiaron. Para cuantificar la diferenciación adipogénica, la tinción Oil Red O se eluyó agregando 100% de isopropanol (Sigma-Aldrich) durante 10 minutos a temperatura ambiente. La absorbancia a 490 nm se leyó por triplicado.
Para osteogénesis, 0,95 x 104 Las células en el paso 1 o 2 se sembraron en una placa de 24 pocillos y se cultivaron en 1 ml de MSCGM. El medio se reemplazó con 1 ml de medio de diferenciación de osteogénesis STEMPRO completo (Invitrogen) una vez que las células tuvieron una confluencia del 50 al 70 %. Las células se mantuvieron en medio osteogénico durante 2 semanas con cambios de medio dos veces por semana. Los cultivos osteogénicos se fijaron en 1 ml de etanol al 70 % helado (Sigma-Aldrich) durante 1 h a 4 °C y se tiñeron con Alizarin Red S 4 mM en agua destilada (pH ajustado a 4,2 con hidróxido de amonio; Sigma-Aldrich) durante 10 min a temperatura ambiente. Se eliminó el exceso de tinte y se lavó cuatro veces con agua. Las células fueron fotografiadas con un microscopio óptico. Para cuantificar la diferenciación osteogénica, se agregaron 400 ml de ácido acético al 10% (vol/vol) a cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos con agitación. Las células se rasparon suavemente con un raspador de células y se transfirieron con ácido acético al 10 % (vol/vol) (Sigma-Aldrich) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. El tubo se selló con parafilm, se agitó…
